Kvapalinová chromatografia je hlavnou metódou na testovanie obsahu každej zložky a nečistôt v surovinách, medziproduktoch, prípravkoch a obalových materiáloch, ale mnohé látky nemajú štandardné metódy, na ktoré sa možno spoliehať, takže je nevyhnutné vyvinúť nové metódy. Pri vývoji metód v kvapalnej fáze je jadrom kvapalinovej chromatografie chromatografická kolóna, preto je rozhodujúci výber vhodnej chromatografickej kolóny. V tomto článku autor vysvetlí, ako si vybrať kolónu pre kvapalinovú chromatografiu z troch hľadísk: celkové nápady, úvahy a rozsah použitia.
A. Celkové nápady na výber kolón pre kvapalinovú chromatografiu
1. Vyhodnoťte fyzikálne a chemické vlastnosti analytu: ako je chemická štruktúra, rozpustnosť, stabilita (napríklad, či je ľahké ho oxidovať/redukovať/hydrolyzovať), kyslosť a zásaditosť atď., kľúčová je najmä chemická štruktúra faktor pri určovaní vlastností, ako napríklad, že konjugovaná skupina má silnú ultrafialovú absorpciu a silnú fluorescenciu;
2. Určite účel analýzy: či je potrebná vysoká separácia, vysoká účinnosť kolóny, krátky čas analýzy, vysoká citlivosť, odolnosť voči vysokému tlaku, dlhá životnosť kolóny, nízke náklady atď.;
- Vyberte si vhodnú chromatografickú kolónu: pochopte zloženie, fyzikálne a chemické vlastnosti chromatografického plniva, ako je veľkosť častíc, veľkosť pórov, teplotná tolerancia, pH tolerancia, adsorpcia analytu atď.
- Úvahy o výbere kolón pre kvapalinovú chromatografiu
Táto kapitola bude diskutovať o faktoroch, ktoré je potrebné zvážiť pri výbere chromatografickej kolóny z hľadiska fyzikálnych a chemických vlastností samotnej chromatografickej kolóny. 2.1 Výplňová matrica
2.1.1 Silikagélová matrica Výplňovou matricou väčšiny kvapalinových chromatografických kolón je silikagél. Tento typ plniva má vysokú čistotu, nízku cenu, vysokú mechanickú pevnosť a ľahko sa modifikujú skupiny (ako je fenylová väzba, amino väzba, kyano väzba atď.), ale hodnota pH a teplotný rozsah, ktorý toleruje, sú obmedzené: Rozsah pH väčšiny plnív na báze silikagélu je 2 až 8, ale rozsah pH špeciálne upravených fáz viazaných na silikagél môže byť až 1,5 až 10 a existujú aj špeciálne modifikované fázy viazané na silikagél, ktoré sú stabilné pri nízkom pH, ako je Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, ktorý je stabilný pri pH 1 až 8; horný teplotný limit silikagélovej matrice je zvyčajne 60 ℃ a niektoré chromatografické kolóny môžu tolerovať teplotu 40 ℃ pri vysokom pH.
2.1.2 Polymérna matrica Polymérne plnivá sú väčšinou polystyrén-divinylbenzén alebo polymetakrylát. Ich výhodou je, že znesú široký rozsah pH – dajú sa použiť v rozmedzí 1 až 14 a sú odolnejšie voči vysokým teplotám (dosahujú aj nad 80 °C). V porovnaní s plnivami C18 na báze oxidu kremičitého má tento typ plniva silnejšiu hydrofóbnosť a makroporézny polymér je veľmi účinný pri separácii vzoriek, ako sú proteíny. Jeho nevýhodou je, že účinnosť kolóny je nižšia a mechanická pevnosť je slabšia ako u plnív na báze oxidu kremičitého. 2.2 Tvar častíc
Väčšina moderných HPLC plnív sú sférické častice, ale niekedy sú to nepravidelné častice. Sférické častice môžu poskytnúť nižší tlak v kolóne, vyššiu účinnosť kolóny, stabilitu a dlhšiu životnosť; pri použití vysokoviskóznych mobilných fáz (ako je kyselina fosforečná) alebo keď je roztok vzorky viskózny, nepravidelné častice majú väčší špecifický povrch, čo viac prispieva k plnému pôsobeniu dvoch fáz, a cena je relatívne nízka. 2.3 Veľkosť častíc
Čím menšia je veľkosť častíc, tým vyššia je účinnosť kolóny a vyššia separácia, ale tým horšia je odolnosť voči vysokému tlaku. Najčastejšie používanou kolónou je kolóna s veľkosťou častíc 5 μm; ak je požiadavka na separáciu vysoká, možno zvoliť plnivo 1,5-3 μm, čo prispieva k riešeniu problému separácie niektorých zložitých matricových a viaczložkových vzoriek. UPLC môže používať 1,5 μm plnivá; Pre semipreparatívne alebo preparatívne kolóny sa často používajú plnivá s veľkosťou častíc 10 μm alebo väčšou. 2.4 Obsah uhlíka
Obsah uhlíka sa vzťahuje na podiel viazanej fázy na povrchu silikagélu, ktorý súvisí so špecifickým povrchom a pokrytím viazanou fázou. Vysoký obsah uhlíka poskytuje vysokú kapacitu kolóny a vysoké rozlíšenie a často sa používa pre zložité vzorky vyžadujúce vysokú separáciu, ale v dôsledku dlhého času interakcie medzi dvoma fázami je čas analýzy dlhý; Chromatografické kolóny s nízkym obsahom uhlíka majú kratší čas analýzy a môžu vykazovať rôznu selektivitu a často sa používajú pre jednoduché vzorky, ktoré vyžadujú rýchlu analýzu a vzorky, ktoré vyžadujú podmienky s vysokým obsahom vodnej fázy. Vo všeobecnosti sa obsah uhlíka C18 pohybuje od 7 % do 19 %. 2.5 Veľkosť pórov a špecifický povrch
Adsorpčné médiá HPLC sú porézne častice a väčšina interakcií prebieha v póroch. Preto musia molekuly vstúpiť do pórov, aby sa adsorbovali a oddelili.
Veľkosť pórov a špecifický povrch sú dva komplementárne pojmy. Malá veľkosť pórov znamená veľký špecifický povrch a naopak. Veľký špecifický povrch môže zvýšiť interakciu medzi molekulami vzorky a naviazanými fázami, zlepšiť retenciu, zvýšiť zaťaženie vzorky a kapacitu kolóny a separáciu zložitých zložiek. Plne porézne plnivá patria k tomuto typu plnív. Pre tých, ktorí majú vysoké požiadavky na separáciu, sa odporúča zvoliť plnivá s veľkým špecifickým povrchom; malá špecifická plocha povrchu môže znížiť protitlak, zlepšiť účinnosť kolóny a skrátiť dobu rovnováhy, čo je vhodné pre gradientovú analýzu. K tomuto typu plnív patria plnivá s jadrom a plášťom. Na základe predpokladu zabezpečenia separácie sa odporúča zvoliť plnivá s malým špecifickým povrchom pre plnivá s vysokými požiadavkami na účinnosť analýzy. 2.6 Objem pórov a mechanická pevnosť
Objem pórov, tiež známy ako „objem pórov“, sa vzťahuje na veľkosť prázdneho objemu na jednotku častice. Môže dobre odrážať mechanickú pevnosť plniva. Mechanická pevnosť plnív s veľkým objemom pórov je o niečo slabšia ako u plnív s malým objemom pórov. Plnivá s objemom pórov menším alebo rovným 1,5 ml/g sa väčšinou používajú na HPLC separáciu, zatiaľ čo plnivá s objemom pórov väčším ako 1,5 ml/g sa používajú hlavne na molekulovú vylučovaciu chromatografiu a nízkotlakovú chromatografiu. 2.7 Miera obmedzenia
Zakrytie môže znížiť koncové vrcholy spôsobené interakciou medzi zlúčeninami a exponovanými silanolovými skupinami (ako je iónová väzba medzi alkalickými zlúčeninami a silanolovými skupinami, van der Waalsove sily a vodíkové väzby medzi kyslými zlúčeninami a silanolovými skupinami), čím sa zlepší účinnosť kolóny a tvar vrcholu . Nekryté viazané fázy budú produkovať rôzne selektivity v porovnaní s uzavretými viazanými fázami, najmä pre polárne vzorky.
- Rozsah použitia rôznych kolón pre kvapalinovú chromatografiu
Táto kapitola popisuje rozsah použitia rôznych typov kolón pre kvapalinovú chromatografiu prostredníctvom niektorých prípadov.
3.1 C18 chromatografická kolóna s reverznou fázou
Kolóna C18 je najbežnejšie používaná kolóna s reverznou fázou, ktorá vyhovuje testom obsahu a nečistôt väčšiny organických látok a je použiteľná pre stredne polárne, slabo polárne a nepolárne látky. Typ a špecifikácia chromatografickej kolóny C18 by sa mala zvoliť podľa špecifických požiadaviek na separáciu. Napríklad pre látky s vysokými požiadavkami na separáciu sa často používajú špecifikácie 5 μm*4,6 mm*250 mm; pre látky s komplexnými separačnými matricami a podobnou polaritou sa môžu použiť špecifikácie 4 μm*4,6 mm*250 mm alebo menšie veľkosti častíc. Autor napríklad použil kolónu 3 μm x 4,6 mm x 250 mm na detekciu dvoch genotoxických nečistôt v celekoxibovej API. Oddelenie týchto dvoch látok môže dosiahnuť 2,9, čo je vynikajúce. Okrem toho, za predpokladu zabezpečenia separácie, ak sa vyžaduje rýchla analýza, často sa volí krátka kolóna 10 mm alebo 15 mm. Napríklad, keď autor použil LC-MS/MS na detekciu genotoxickej nečistoty v piperachínfosfátovej API, použila sa kolóna 3 um x 2,1 mm x 100 mm. Separácia medzi nečistotou a hlavnou zložkou bola 2,0 a detekcia vzorky môže byť dokončená za 5 minút. 3.2 Fenylový stĺpec s reverznou fázou
Fenylová kolóna je tiež typ kolóny s reverznou fázou. Tento typ kolóny má silnú selektivitu pre aromatické zlúčeniny. Ak je odozva aromatických zlúčenín meraná bežnou C18 kolónou slabá, môžete zvážiť výmenu fenylovej kolóny. Napríklad, keď som robil celecoxib API, odozva hlavnej zložky meraná fenylovou kolónou toho istého výrobcu a rovnakej špecifikácie (všetky 5 μm x 4,6 mm x 250 mm) bola asi 7-krát väčšia ako v kolóne C18. 3.3 Kolóna normálnej fázy
Ako účinný doplnok ku kolóne s reverznou fázou je kolóna s normálnou fázou vhodná pre vysoko polárne zlúčeniny. Ak je pík stále veľmi rýchly pri elúcii s viac ako 90 % vodnej fázy v kolóne s reverznou fázou a dokonca je blízko píku rozpúšťadla a prekrýva sa s ním, môžete zvážiť výmenu kolóny s normálnou fázou. Tento typ kolóny zahŕňa hilic kolónu, amino kolónu, kyano kolónu atď.
3.3.1 Hilic kolóna Hilic kolóna zvyčajne obsahuje hydrofilné skupiny vo viazanom alkylovom reťazci na zvýšenie odozvy na polárne látky. Tento typ kolóny je vhodný na analýzu cukrových látok. Autor použil tento typ stĺpca pri stanovovaní obsahu a súvisiacich látok xylózy a jej derivátov. Izoméry derivátu xylózy môžu byť tiež dobre oddelené;
3.3.2 Amino kolóna a kyano kolóna Amino kolóna a kyano kolóna označujú zavedenie amino a kyano modifikácií na konci viazaného alkylového reťazca, aby sa zlepšila selektivita pre špeciálne látky: napríklad amino kolóna je dobrou voľbou na separáciu cukrov, aminokyselín, zásad a amidov; kyano kolóna má lepšiu selektivitu pri oddeľovaní hydrogenovaných a nehydrogenovaných štruktúrne podobných látok v dôsledku prítomnosti konjugovaných väzieb. Amino kolóna a kyano kolóna môžu byť často prepínané medzi kolónou s normálnou fázou a kolónou s reverznou fázou, ale časté prepínanie sa neodporúča. 3.4 Chirálny stĺpec
Chirálna kolóna, ako už názov napovedá, je vhodná na separáciu a analýzu chirálnych zlúčenín najmä v oblasti liečiv. Tento typ kolóny možno zvážiť, keď konvenčné kolóny s reverznou fázou a normálnou fázou nemôžu dosiahnuť oddelenie izomérov. Napríklad autor použil chirálnu kolónu 5 μm*4,6 mm*250 mm na oddelenie dvoch izomérov 1,2-difenyletyléndiamínu: (1S,2S)-1,2-difenyletyléndiamínu a (1R,2R)-1,2 -difenyletyléndiamínu a separácia medzi nimi dosiahla asi 2,0. Chirálne kolóny sú však drahšie ako iné typy kolón, zvyčajne 1W+/kus. Ak sú takéto stĺpce potrebné, jednotka musí vytvoriť dostatočný rozpočet. 3.5 Stĺpec na výmenu iónov
Iónomeničové kolóny sú vhodné na separáciu a analýzu nabitých iónov, ako sú ióny, proteíny, nukleové kyseliny a niektoré cukrové látky. Podľa typu plniva sa delia na katexové kolóny, anexové kolóny a silné katexové kolóny.
Medzi katiónové výmenné kolóny patria kolóny na báze vápnika a vodíka, ktoré sú vhodné hlavne na analýzu katiónových látok, ako sú aminokyseliny. Autor napríklad použil stĺpce na báze vápnika pri analýze glukonátu vápenatého a octanu vápenatého v preplachovacom roztoku. Obe látky mali silné odozvy pri λ=210 nm a stupeň separácie dosiahol 3,0; autor použil stĺpce na báze vodíka pri analýze látok súvisiacich s glukózou. Niekoľko hlavných príbuzných látok – maltóza, maltotrióza a fruktóza – malo pri diferenciálnych detektoroch vysokú citlivosť s detekčným limitom len 0,5 ppm a stupňom separácie 2,0 – 2,5.
Aniónové výmenné kolóny sú vhodné hlavne na analýzu aniónových látok, ako sú organické kyseliny a halogénové ióny; silné katexové kolóny majú vyššiu iónomeničovú kapacitu a selektivitu a sú vhodné na separáciu a analýzu komplexných vzoriek.
Vyššie uvedené je len úvodom do typov a rozsahov použitia niekoľkých bežných kvapalinových chromatografických kolón v kombinácii s vlastnými skúsenosťami autora. Existujú aj iné špeciálne typy chromatografických kolón v aktuálnych aplikáciách, ako sú chromatografické kolóny s veľkými pórmi, chromatografické kolóny s malými pórmi, kolóny pre afinitnú chromatografiu, multimódové chromatografické kolóny, kolóny pre ultra vysokoúčinnú kvapalinovú chromatografiu (UHPLC), kolóny pre superkritickú kvapalinovú chromatografiu ( SFC) atď. Hrajú dôležitú úlohu v rôznych oblastiach. Konkrétny typ chromatografickej kolóny by sa mal vybrať podľa štruktúry a vlastností vzorky, požiadaviek na separáciu a iných účelov.
Čas odoslania: 14. júna 2024